高背景 troubleshooting 速查手册

原因 1：洗涤不充分

解决：每孔加液 ≥300μL，洗涤 5-6 次，每次浸泡 30-60 秒。手工洗板注意拍干力度。

## 原因 2：封闭不足

解决：1-5% BSA 或 5% 脱脂奶粉封闭 1-2 小时。高背景板可过夜封闭于 4°C。

## 原因 3：抗体浓度过高

解决：棋盘滴定法确定最佳浓度。捕获抗体通常 1-5 μg/mL，检测抗体 0.1-1 μg/mL。

## 原因 4：底物污染

解决：TMB 应无色透明，现配现用。避免接触金属器具。

## 原因 5：孵育温度过高

解决：严格 37°C ± 1°C，超过 40°C 会显著增加非特异结合。

## 原因 6：样本基质效应

解决：样本适当稀释（1:2 至 1:10），或使用专用样本稀释液。